賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用全攻略：從入門到精通

賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號11668019）應(yīng)用全攻略：從入門到精通

一、產(chǎn)品核心優(yōu)勢與應(yīng)用場景

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾推出的明星級陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，廣泛用于DNA/RNA的哺乳動物細(xì)胞遞送。其核心優(yōu)勢體現(xiàn)在：

· 高轉(zhuǎn)染效率：適用于貼壁細(xì)胞（HEK293、HeLa）和懸浮細(xì)胞（CHO、Jurkat），DNA轉(zhuǎn)染效率可達85%-95%（數(shù)據(jù)來源：Thermo Fisher Protocol）

· 低細(xì)胞毒性：通過優(yōu)化脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，48小時培養(yǎng)后細(xì)胞存活率≥90%

· 多場景適配：支持質(zhì)粒DNA、siRNA、miRNA及CRISPR/Cas9系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（以24孔板為例）

1. 試劑準(zhǔn)備

· 稀釋DNA：需保持無菌環(huán)境，推薦使用Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號31985070）將DNA稀釋至0.5-2 μg/μL

· 脂質(zhì)體混合：Lipofectamine 2000與稀釋液比例為1:25（如：1 μL試劑+24 μL培養(yǎng)基）

2. 復(fù)合物形成

· 將脂質(zhì)體稀釋液與DNA稀釋液按1:1體積混合

· 關(guān)鍵步驟：室溫靜置20分鐘，形成穩(wěn)定脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物（時間偏差＞5分鐘會導(dǎo)致效率下降10%-15%）

3. 細(xì)胞處理

· 貼壁細(xì)胞需達到70%-80%融合度

· 每孔加入100 μL復(fù)合物，37℃孵育6小時后換液

三、針對不同細(xì)胞類型的優(yōu)化策略

四、三大常見問題解決方案

1. 轉(zhuǎn)染效率低

· 排查方向：DNA純度（OD260/280需在1.8-2.0）、細(xì)胞狀態(tài)（傳代次數(shù)≤15）

· 優(yōu)化方案：添加增強劑（如PlasmidPlus，貨號A31852）

2. 細(xì)胞毒性顯著

· 原因分析：脂質(zhì)體過量或孵育時間過長

· 改進措施：將轉(zhuǎn)染時間縮短至4小時，DNA濃度降低30%

3. RNA干擾效率不佳

· 技術(shù)要點：siRNA終濃度控制在20-50 nM，推薦使用Silencer Select系列（貨號4392420）

· 驗證方法：設(shè)置Cy3標(biāo)記siRNA對照組，熒光顯微鏡觀察攝取效率

五、高階應(yīng)用：CRISPR遞送實例

Protocol亮點：

· Cas9質(zhì)粒與sgRNA質(zhì)量比采用1:3（如 1 μg : 3 μg）

· 共轉(zhuǎn)染熒光報告系統(tǒng)（如pEGFP-N1，貨號6085-1）

· 使用流式細(xì)胞術(shù)篩選后，基因編輯效率提升40%（參考文獻：Nat Methods 2016）

六、保存與質(zhì)量控制

存儲條件：4℃避光保存，避免反復(fù)凍融（凍融超3次活性下降50%）

有效期驗證：開封后6個月內(nèi)使用，每月進行轉(zhuǎn)染陽性對照實驗

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：每批次均通過HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染測試，EGFP表達率≥85%

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