免疫組化（IHC）SP法，原來如此簡單！

免疫組化，是應用免疫學基本原理-抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。

一、SP法步驟

1. SP三步法

脫蠟→梯度水化→滅活內源性過氧化物酶→抗原修復→封閉→一抗孵育→二抗孵育→SP反應→DAB顯色→蘇木素復染→常規脫水→透明→封片

2、免疫組化的關鍵環節

①脫蠟和水化

②抗原修復

③滅活內源性過氧化物酶和生物素

④血清封閉

⑤一抗和二抗濃度和孵育時間

⑥切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

⑦DAB顯色

⑧復染

⑨脫水透明

⑩封片

二、異常分析

1、非特異性染色

①抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。

②一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體。

③內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。

④非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

⑤DAB孵育時間過長或濃度過高。

⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

⑦標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

2、呈陰性結果

①抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。

②抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合。

③組織切片本身這種抗原含量低。

④血清封閉時間過長。DAB孵育時間過短。

⑤細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

三、重要信息

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