懸浮細胞的瞬時轉染操作

　　知道懸浮細胞的瞬時轉染操作有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

　　一、細胞轉染前的準備

　　1、細胞：

　　貼壁生長細胞：一般要求在轉染前一日，必須應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70-90%（貼壁細胞），最好在轉染前2-4 h換一次新鮮培養液。

　　懸浮細胞：轉染前12-16 h進行懸浮細胞傳代，傳代后適宜的細胞密度為20-40×104/mL。臺盼藍染色進行活細胞計數保持活細胞比在95%以上。

　　提前將293F細胞的密度調整至合適的密度后（2×106-4×106細胞/ml）于37℃搖床培養2-4 h后進行轉染。注意，參與轉染的細胞必須是培養三代或以上的穩定細胞株。

　　2、DNA：

　　使用去內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。

　　3、稀釋液：

　　于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。

　　4、轉染試劑：

　　轉染試劑如PEI溶液長期儲存于-20℃，不可反復凍融，溶液在4℃放置不超過一周。

　　二、操作步驟（懸浮細胞）

　　1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應體積的300 mM NaCl稀釋，用槍頭混勻后靜置5 min；

　　另取一支已滅菌的Ep管，加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉染體積的5%）。

　　將質粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時間，使DNA與PEI形成穩定的聚合物。

　　2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉染更加充分。

　　3、轉染后將懸浮細胞置于搖床中培養，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進行細胞計數并用臺盼藍染色液觀察細胞的存活率。

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