蛋白質(zhì)提純的注意事項(xiàng)和常見問題有什么？

在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化的時(shí)候，都要時(shí)刻注意維護(hù)它的穩(wěn)定性，保護(hù)它的活性，那么你知道蛋白質(zhì)提純的注意事項(xiàng)和常見問題有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、注意事項(xiàng)：

1、操作盡可能置于冰上或者在冷庫內(nèi)進(jìn)行。

2、濃度不要太稀，蛋白濃度維持在μg/mL～mg/mL。

3、選擇合適的pH，除非是進(jìn)行聚焦層析，所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同，防止蛋白質(zhì)的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制劑，防止蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解；在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA對(duì)蛋白的污染。

5、避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動(dòng)，以防蛋白質(zhì)的變性。

6、緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

7、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或β-巰基乙醇），防止蛋白質(zhì)的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑，防止重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞。

9、使用滅菌溶液，防止微生物生長。

二、常見問題：

1、通過 His 標(biāo)簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進(jìn)？

（1）如果純化的是上清，蛋白酶會(huì)部分降解目的蛋白，可通過加多種蛋白酶抑制劑改進(jìn)。

（2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。

（3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

2、鎳柱使用中出現(xiàn)棕色的原因

（1）柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心，并過0.22或者0.45的膜。

（2）上清純化時(shí)，蛋白發(fā)生變性，有絮狀物產(chǎn)生，趕緊加入 1-2mM DTT （上清樣品處理要在冰浴中進(jìn)行），還不行加尿素變性，使其在變形環(huán)境下。

（3）樣品處理時(shí)的料液比不要太小，否則黏度大，或者導(dǎo)致蛋白析出或變性，料液比要在 1/10-1/15 之間較適宜。

3、純化過程中蛋白出現(xiàn)了渾濁應(yīng)如何處理？

（1）出現(xiàn)渾濁，說明蛋白處在不穩(wěn)定的環(huán)境中或者自身就不穩(wěn)定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環(huán)境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑 DTT。

（2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現(xiàn)象。

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