細胞凍存與復蘇

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，利用凍存技術將細胞冷凍保存在-196℃液氮中，可以使細胞暫時停止生長并保留細胞特性，以便在需要時再復蘇細胞用于實驗。同時保存適量的細胞，可以防止細胞在培養過程中因受到污染或其他意外事件導致細胞丟種，起到細胞保種的作用。

細胞凍存和復蘇采取“慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細胞內的水份滲出細胞外，減少細胞內形成冰晶的機會；快融以保證細胞外結晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細胞內，再次形成胞內冰晶造成對細胞的損傷。

細胞凍存時需向培養基中加入冷凍保護劑，可保護細胞在冷凍時免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑可根據其是否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性兩類：

1.滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2.非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥YI基淀粉等。

（一）細胞凍存一般步驟

1. 準備已滅菌的凍存培養液，并4℃預冷；

2. 選取對數生長期的細胞，棄掉細胞培養液，用細胞消化酶（如胰蛋白酶）進行消化，適時去掉消化液，加入少量新鮮培養液。懸浮生長的細胞不進行消化處理，直接將細胞收集于離心管中離心，1000 rpm，5-10 min；

3. 棄去上清液，逐漸加入適量預冷的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節細胞濃度在5×10⁶～1×10⁷/mL之間；

4. 將上述細胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱、凍存日期和操作者；

5. 凍存：標準的降溫速率開始為-1～-2℃/ min，當溫度降到-80℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

（二）細胞復蘇一般步驟

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快融化；

2. 從37℃水浴中取出凍存管，在無菌條件下取出細胞，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻，以1000 rpm，5-10 min離心；

4. 棄去上清液，加入適量培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度后接種到培養瓶中，37℃培養箱靜置培養；

5. 次日更換一次培養液，繼續培養。

（三）注意事項

1. 配制好的細胞凍存液要進行預冷，新鮮配制的凍存液會產生大量的熱。

2. 凍存的細胞在半年后，建議取出一只凍存管細胞復蘇培養，觀察生長情況，然后再繼續凍存。