慢病毒包裝

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。所以，在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。

      在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過使用病毒介導(dǎo)的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，達(dá)到目的基因高效表達(dá)的目的。

       具體來說，慢病毒包裝主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：

       1、對于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究；

       2、進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；

       3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；

       為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，通常需要利用慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。

       慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)方法

        1.構(gòu)建含有目的基因的慢病毒表達(dá)載體

        2.細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞傳代后，密度達(dá)到70％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

        3.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：取兩個(gè)EP管，一個(gè)（A管）加入慢病毒載體的表達(dá)質(zhì)粒、混合包裝質(zhì)粒和Opti-MEMI；另一個(gè)（B管）加入Opti-MEMI、轉(zhuǎn)染試劑，一邊輕柔渦旋A管，一邊往A管滴加B管的溶液。溶液混合后，室溫放置10-25分鐘，即完成轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備。

        4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；

        5.收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；